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2.5. Phosphat in der Wurst?

Es ist doch erstaunlich, daß der in Metzgereien oder anderswo anzutreffende Hinweis "mit Phosphat", der wohl jedem bekannt ist, solche Fehlinterpretationen wie "enthält Phosphat, damit das Würstchen schön rot wird" (Assoziation an den roten Zündkopf der Streichhölzer?) folgen läßt. Das zeigt doch, wie unzureichend der Verbraucher oft aufgeklärt ist. Was steckt nun hinter der Bezeichnung "mit Phosphat"?

2.5.1. Qualitativer Nachweis von Phosphaten

Hierzu wurde das Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG L.06.00.15 eingesetzt, wobei abweichend von den Angaben DC-Platten mit nur 0,1 mm Schichtdicke verwendet wurden. Somit war es nötig, die Auftragemengen und die Trocknungstemperatur und -zeit zu reduzieren. Andernfalls erfolgt eine braune Verfärbung der Platten.

2.5.1.1. Prinzip und Durchführung

Der Nachweis erfolgt über eine dünnschichtchromatographische Trennung. Dabei steigt in der Trennkammer das Fließmittelgemisch (=mobile Phase) durch Kapillarkräfte in der Celluloseschicht (=stationäre Phase) hoch. Gleichzeitig läuft es über die Auftrageflecken der Proben- und Testlösungen. Eine Auftrennung der Verbindungen eines "Fleckes" ist möglich, falls unterschiedlich starke Wechselwirkungen dieser mit der stationären Phase vorliegen. Die Adsorption steigt bei den Phosphaten mit dem Kondensationsgrad an. Als Fällungsreagenz wird Ammoniumheptamolybdat im sauren Medium gelöst. Dadurch entsteht die Isopolymolybdänsäure (vereinfacht: H2MoO4-polymer). Beim Aufsprühen dieser werden kondensierte Phosphate hydrolysiert, und es entsteht die Heteropolysäure Phosphormolybdänsäure (PMS) (Abb.14a). Die Hydrolyse wird durch Wärmeeinwirkung vervollständigt. Entsprechend werden evtl. gelbe Flecken (beta-PMS) sichtbar (alpha-PMS ist farblos). Durch das Reduktionsreagenz Zinn(II)-chlorid in salzsaurer Lösung werden bestimmte Mo-Atome innerhalb der PMS-Struktur, die selbst erhalten bleibt, vom 6-wertigen in den 5-wertigen Zustand überführt. Ein Teil der O- und H-Atome liegt dann in Form von OH-Gruppen vor. Da unterschiedlich viele Elektronen aufgenommen werden können, gibt es eine große Zahl von Reaktionsprodukten, die zusammengefaßt als Phosphormolybdänblau (PMB) bezeichnet werden. Der genaue Reaktionsverlauf ist noch nicht geklärt (Abb.14b,c).[37]

Die Intensität der nach dem Aufsprühen entstehenden blauen Flecken ist der Monophosphat-Konzentration proportional.

Abb. 14: Die PMB-Reaktion

Mono-, Di- und Triphosphat sind in Wasser und in schwach sauren Medien löslich. Die Trichloressigsäure dient als Fällungsreagenz für Proteine. Die Phosphate werden aus der Probe extrahiert und stehen im Filtrat für den Nachweis zur Verfügung. Anhand der RF-Werte, die man durch Testlösungen ermittelt, können die durch eine Probe sichtbar gewordenen Flecken zugeordnet und identifiziert werden. Da kondensierte Phosphate sehr hydrolyseempfindlich (Wärme, Säure) sind, muß rasch gearbeitet werden, und die Auftragestellen müssen sofort im kalten Luftstrom getrocknet werden. Diese Methode kann im Schuleinsatz vereinfacht und unter Verwendung schulüblicher Geräte durchgeführt werden.[37] [38] [39]

2.5.1.2. Ergebnisse

Abb. 15 (GIF 119k): Ergebnisse; mit 1-6=Probennummer, T=Mono-, Di-, Triphosphatstandard, M=P3; Ö=P7

Unter den gewählten Bedingungen ergeben sich folgende RF-Werte: für Monophosphat RF~0,72, für Diphosphat RF~0,49, für Triphosphat RF~0,33. Anhand der RF-Werte können die Phosphatfraktionen der untersuchten Proben identifiziert werden. So taucht Diphosphat bei P1, P2 und P3 auf. Weiterhin ist bei keiner Probe ein Triphosphatfleck vorhanden, während eine Monophosphatfraktion überall auftritt.

2.5.1.3. Diskussion

Als erstes bleibt anzumerken, daß die Bezeichnung "mit Phosphat" eigentlich irreführend ist, da in jeder Wurst zumindest Monophosphat enthalten ist, das als Mineralstoff im Sarkoplasma gelöst wichtige Aufgaben im lebenden Organismus übernimmt. Diese Fraktion enthält daneben durch Abbauprozesse von kondensierten Phosphaten entstandenes Monophosphat.

Die Ergebnisse zeigen, daß P1, P2 und P3 unter Einsatz von Diphosphat hergestellt wurden. Also wurde nicht schlachtwarmes Fleisch verwendet, da dabei ein Zusatz von Diphosphat verboten ist. Aus Erkundigungen in mehreren handwerklichen Betrieben kann eine Tendenz zur Auswahl von hauptsächlich Diphosphat als Kutterhilfsmittel festgestellt werden. Zulässig sind Diphosphate, die in einer 0,5%igen wässrigen Lösung pH=7.3 nicht überschreiten, also Na3HP2O7 oder K3HP2O7, wohingegen eine Betrachtung der Zutatenlisten verpackter Brühwurstsorten eine fast ausschließliche Verwendung von Citrat (Tab.3) als solches ergibt. Das Ausbleiben eines Diphosphatfleckes bei P4 bestätigt dies. Auf die zugrundeliegenden Motive des jeweiligen Gebrauches soll an dieser Stelle nicht eingegangen werden.

Kuttersalze haben die Aufgabe, die Wasserbindekapazität und somit auch die Fettbindung zu erhöhen. Da dies nur bei den Brühwürsten ein technologisches Ziel ist, hat der Einsatz also nur hier einen Sinn und ist auch nur hier erlaubt (bei Rohwurst ist gerade das Gegenteil ein Ziel, nämlich die Wasserabgabe!). Obwohl auch bei der untersuchten Leberwurst Wasser bzw. Kesselbrühe im Laufe der Herstellung zugegeben wird, können Kuttersalze keine Wirkung entfalten, da das Fleischmaterial vorgebrüht wird, d.h. die Muskelfilamente bereits zerstört sind.

Im lebenden Organismus sind während der Muskelkontraktion die Actin- und Myosinfilamente über Myosinköpfchen fest miteinander verknüpft. ATP besitzt eine höhere Affinität zum Myosin, so daß die Verbindung zwischen den Filamenten gelöst werden kann (Myosin-ATP-Komplex). Die für diese Vorgänge nötige Energie stammt aus der ATP-Hydrolyse. Somit geht der Myosin-ATP-Komplex in einen Myosin-ADP-Pi-Komplex über. Dadurch wird die Affinität soweit herabgesetzt, daß ein erneuter Actomyosinkomplex zustande kommen kann. Die nur durch Einwirken des Triphosphates (=ATP) mögliche Spaltung der Filamente sowie eine erneute Brückenbindung durch Umwandlung in Diphosphat (= ADP) lassen einen Zusatz von Diphosphat (Na3HP2O7) zur Spaltung des Actomyosinkomplexes im Kaltfleisch zunächst recht widersprüchlich erscheinen. Da aber das als Kuttersalz verwendete Diphosphat in ähnlicher Weise den Komplex zu lösen vermag, ist dies Hinweis, daß es wohl auf die Molekülform ankommt und nicht auf den Kondensationsgrad der Phosphate. Das Kuttersalz besitzt eine höhere Affinität zu Myosin als Actin und sogar eine höhere als ATP. Versuche mit anderen Triphosphaten[39] zeigten auch eine geringere Wirkung auf das WBV. Das Ausbleiben einer Triphosphatfraktion, die von ATP verursacht werden würden, zeigt, daß dessen Konzentration unter die Nachweisgrenze abgesunken ist. Die untersuchte P7 enthält kein Diphosphat (Abb.15). Auch andere Kutterhilfsmittel wurden nicht verwendet [26] (eine Nachprüfung fand dazu allerdings nicht statt). Somit kann aus Kaltfleisch, welches dabei verarbeitet wurde, eine Brühwurst mit den erwünschten Eigenschaften auch ohne Diphosphat hergestellt werden. Die Bindigkeit des Brätes wird nämlich noch von weiteren Faktoren beeinflußt, wobei auch die Fleischqualität eine Rolle spielt.

Die durch die FlV festgelegte zulässige Höchstmenge von zugesetztem Diphosphat zu nicht schlachtwarmem Fleisch liegt bei 0,3% bezogen auf Fleisch- und Fettmenge. Dennoch ist in der amtlichen Sammlung kein Verfahren enthalten, um den Gehalt im Produkt quantitativ zu bestimmen. Eine Überdosierung hat einerseits sensorische Nachteile, da blasse Farbe und Geschmacksabweichungen die Folgen sind. Andererseits liegt der technologisch optimale Wert bei einer Dosierung von 0,15-0,2%. Hinzu kommt die völlige Unbedenklichkeit aus gesundheitlichen Gesichtspunkten bei praxisüblichen Einsatzmengen. Deshalb könnte es für Untersuchungen der Lebensmittelüberwachung uninteressant sein, eine quantitative Bestimmung durchzuführen.[11][39] Das zugesetzte und das natürlich in Rohstoffen enthaltene Phosphat kann aber insgesamt erfaßt werden.

2.5.2. Quantitative Bestimmung des Gesamtphosphorgehaltes

Dieses Verfahren wurde von W. Arneth und B. Herold[40] 1983 erarbeitet und stellt eine Vereinfachung der amtlichen Untersuchungsmethode (§35 LMBG, L 06.00-9) dar. Dennoch führt dies zu keinen Nachteilen in Bezug auf die Genauigkeit der Ergebnisse.

2.5.2.1.Prinzip und Durchführung

Um den gesamten Phosphorgehalt einer Probe erfassen zu können, muß dieser in eine zur Bestimmung geeignete Verbindung überführt werden. Dazu wird ein trockener Aufschluß durch Veraschen durchgeführt, nachdem der Hauptteil des organischen Materials verbrannt wurde. Beim Glühen (ca. 600°C) finden weitgehende Veränderungen der enthaltenen Substanzen statt. Die Asche (=trockener Rückstand der verlustfreien Zerstörung) enthält anorganische Verbindungen (Mineralstoffe wie PO43-), die in ein Salzgemisch überführt wurden, sowie aus organischen Substanzen mineralisierte Verbindungen. U.a. verbleiben aus organischen Phosphorverbindungen Phosphate als Rückstand. Durch den Erhitzungsvorgang wandeln sich vorliegende primäre und sekundäre Phosphate in z.T. ringförmige Metaphosphate bzw. in Diphosphate um.

Die Asche ist säurelöslich. Durch die pH-abhängige Hydrolyse findet dabei eine Überführung der kondensierten Phosphate in Orthophosphat statt. Unterstützt wird dies durch Wärmezufuhr. Diese Orthophosphationen bilden in saurer Lösung mit Vanadat und Molybdat eine gelb gefärbte stabile Heteropolyverbindung, den Phosphormolybdatvanadat-Komplex. Dieser kann zur photometrischen oder kolorimetrischen Bestimmung genutzt werden. Die Extinktionen sind der Phosphatkonzentration proportional. Der Reaktionsmechanismus sowie die Struktur des Komplexes sind noch nicht geklärt.[37]

Als Veraschungshilfsmittel wird Magnesiumacetatlösung zugesetzt. Frei werdendes CO2 lockert die Probe auf. So wird einer unvollständigen Verbrennung sowie einem Aufbrausen der Asche beim späteren Lösen entgegengewirkt. Vor allem bei fettreichen Proben ist ein intensives Trocknen bei 103 ± 2 °C sowie vorsichtiges Erhitzen über der freien Bunsenbrennerflamme notwendig (erhitztes Fett/Wasser-Gemisch spritzt), bevor die Probe bei max. 600 °C geglüht wird. Nach Lösen, Filtration und Farbreaktion kann die Extinktion des gelben Filtrates im Spektralphotometer bei 430 nm gemessen werden. [41] [42]

Diese Methode kann gut mit den in Schulsammlungen vorhanden Geräten durchgeführt werden. Auch kann man einige Arbeitsschritte verkürzen, ohne daß die Ergebnisse wesentlich beeinträchtigt werden.

2.5.2.2. Ergebnisse

Mit Hilfe einer Eichgeraden und deren berechneter Faktoren kann aus den Extinktionen der Gesamtphosphorgehalt als P2O5 ermittelt werden. Die Angaben erfolgen in mg P2O5 pro 100g Probe. Aufgrund der Fehlerabschätzung werden die Ergebnisse auf 2 Stellen nach dem Komma gerundet angegeben. In der Tabelle sind die Mittelwerte der einzelnen Meßreihen aufgeführt. Hier wurde eine weitere Probe analysiert: P8=Hackfleisch vom Schwein.

Tab. 7: Ergebnisse zum Gesamtphosphorgehalt, *mit W4=W1-W4 = "natürlicher"Gesamtphosphorgehalt, DP = Na3HP2O7

2.5.2.3.Diskussion

Wenn man die Ergebnisse der Analysen (W1) mit den Werten des zugesetzten Diphosphates (W3) berechnet als P2O5 vergleicht, so stellt man fest, daß die Erhöhung des Gesamtphosphorgehaltes durch eingesetztes Kutterhilfsmittel zu gering ist, um aus einem Ergebnis einen Rückschluß auf die Anwendung von Diphosphat ziehen zu können. Erschwert wird die Erfassung der zugesetzten Menge zudem, weil der Phosphorgehalt keine konstante Größe in den Wurstprodukten darstellt. Obwohl es sich bei P1-P4 um Brühwurst handelt, also die Rezepte sich durchaus ähneln, schwankt der "natürliche" Phosphorgehalt (W4) erheblich. Auch eine tendenzielle Aussage über den eingesetzten Magerfleischanteil (Magerfleisch enthält wesentlich mehr "Phosphor" als Fettgewebe) läßt sich schwer aus den Ergebnissen ableiten. Rezepturbedingte Zutaten enthalten eben auch "Phosphor", wie aufgeschlossenes Milcheiweiß in P4 oder die Leber in P5. Aus den Ergebnissen läßt sich aber schließen, daß P2 (W1=0,42g P2O5/100g) mehr reines Magerfleisch enthält als die anderen untersuchten Brühwürste (W1(P1)=0,32g P2O5/100g, W1(P3)=0,26g P2O5/100 g, W1(P4)=0,24g P2O5/100g). Die Rezeptur bestätigt dies (Anhang). Nur als ein Vergleichswert wurde W1(P8) ermittelt. Um das eigentliche Ziel, die mengenmäßige Erfassung zugesetzten Diphosphates, zu erreichen, müssen also andere Methoden eingesetzt werden.

2.5.3. Versuch: Quantitative Bestimmung von zugesetztem Diphosphat

2.5.3.1. Chromatographische Methode 1

Die in einer Probe enthaltene Menge an Diphosphat soll anhand der Intensität der zugehörigen Fraktion mit Hilfe von Vergleichsfraktionen bekannter Diphosphatkonzentrationen abgeschätzt werden. Dazu werden unterschiedliche Diphosphatstandardlösungen mit der gleichen Auftragemenge auf der DC-Platte angeordnet, so daß eine "Eichgerade" entsteht. Alles weitere verläuft wie unter 2.2.5.1.1. beschrieben.

Da das Ergebnis auf den gemachten Bildern schlecht zu erkennen ist, soll dies hier graphisch dargestellt werden.

Abb. 16 (GIF 25k): Ergebnis zur Erfassung des zugesetzten Diphosphates, mit a: Standardlösungen (in µg P2O74-/µl); 1=0,4; 7=0,6; 6=0,8; 8=1,0; 9=1,2; b: Probe 3

Demnach kann der Diphosphatgehalt der P3 bei 0,5µg P2O5 pro µl abgeschätzt werden. Bei bekanntem Kutterhilfsmittel (hier Na3HP2O7) kann der Gehalt daraus berechnet werden und ergibt sich zu W3(P3)=0,06g P2O5/100g (=0,1g Na3HP2O7/10g).

2.5.3.2. Chromatographische Methode 2

Um Diphosphat durch hohe Temperaturen nicht zu hydrolysieren, wird die Probe nur mit Trichloressigsäurelösung aufgearbeitet. Die löslichen Phosphate werden extrahiert. Dabei werden von einer Probe zwei Ansätze gemacht, so daß ein Filtrat (a) einer Hydrolyse mit Salpetersäure unterworfen wird, das andere (b) nicht. Die Extinktionen der durch das Reagenz gelb gefärbten Lösungen werden - wie vorher (vgl. Kap. 2.2.5.2.1.) beschrieben - photometrisch bestimmt.

Tab. 8: Berechnung des zugesetzten Diphosphates

2.5.3.3. Diskussion der Ergebnisse

Obwohl mit beiden Methoden ein Diphosphatgehalt ermittelt werden kann, so weicht dieser jedoch von dem theoretisch errechneten Wert (W3(P3)=0,07g P2O5/100g, Tab.7) ab. Bei Betrachtung der Ergebnisse aus Methode 2 fällt weiterhin die doch stark abweichende Menge an erfaßtem Gesamtphosphor von W1(3'a)=0,12g P2O5/100g im Vergleich zu W1(3'a)=0,28g P2O5/100g aus Tab.7 auf. Die möglichen Gründe für die abweichenden Diphosphat- und Gesamtphosporwerte sollen nun erörtert werden. Leider konnte von Mitarbeitern der BAFF keine Bestätigung gegeben werden, da keine intensive Beschäftigung mit diesen Fragen vorlag. Zum Diphosphat: Obwohl dieses wasserlöslich ist, ist ein Aufarbeiten der Probe mit Trichloressigsäurelösung notwendig. Das könnte daran liegen, daß mit dieser nicht nur Eiweiß ausfällt, sondern auch nur so das am Myosin gebundene Diphosphat frei wird, in das Filtrat gelangt und nachgewiesen werden kann. Gleichzeitig ist Diphosphat aber gegenüber Säure hydrolyseempfindlich. Da bei beiden Methoden längere Einwirkungszeiten vorliegen, könnte Diphosphat z.T. hydrolysiert worden sein, bevor es erfaßt werden kann. Bei beiden stellt das Filtrieren einen Arbeitsschritt dar. Daraus könnte sich ein weiterer Verlust ergeben.

Die niedrigen Gesamtphosphorwerte von Methode 2 geben den Hinweis, daß im Organismus bzw. im Fleisch und Fettgewebe Phosphor in einer Weise gebunden ist, die eine Extraktion mit Wasser bzw. Trichloressigsäurelösung unmöglich macht. Phosphor liegt nämlich nicht nur in anorganischer Bindung vor. Als solches aber befindet sich PO43- im Sarkoplasma; weiterhin übernimmt es als Mono-/di-natriumhydrogenphosphat-System wichtige Pufferfunktionen im Blut. Ein größeres Verbreitungsfeld findet der Phosphor in organischen Verbindungen. Der Mensch besteht zu 0,7-14% aus P; Knochen enthalten ca. 11,5%P. Viele Lipide besitzen eine Phosphatesterbindung (Phosphorlipide). Zu diesen gehört die Phosphatidsäure mit ihren Derivaten (Lecithin, Kephalin) als essentielle Bestandteile von Zellmembranen. Weiterhin die Sphingolipide, von denen besonders die Sphingomyeline zu nennen sind, da diese im Nervengewebe enthalten sind. Als prosthetische Gruppen von Proteinen tauchen auch Phosphorverbindungen auf (Phosphorproteide). An vielen zellulären Funktionen sind die Phosphorsäureester beteiligt, die mehr als 3% des organischen Materials in Geweben ausmachen. Dazu gehören die Nucleotide in den Zellkernen sowie im Energiesystem der Zellen (ATP, NAD, FAD, Kreatin). Nucleotide dienen daneben als Carrier, z.B. Uridindiphosphat für die Glykogen-Synthese.

Dieser in organischen Molekülen gebundene Phosphor könnte also zum Großteil nicht durch die Reaktionsbedingungen von Methode 2 abgetrennt werden. Als Fällungsmittel denaturiert die Trichloressigsäure die Eiweißstoffe, somit bleibt ein Teil des Phosphors im Rückstand "festgehalten". Hinzu kommt, daß das Farbreagenz nur mit Orthophosphat-Ionen eine Reaktion eingehen kann, also kann nur der in dieser Form vorliegende Phosphor sichtbar und somit erfaßt werden. Dies alles sind Gründe, weshalb verascht werden muß.[37] [41]

In der Literatur[3] [43] sind weitere Methoden zur Erfassung des Diphosphatgehaltes beschrieben: die Bestimmung der P-Zahl und die Messung der Remission bei 610 nm direkt von der DC-Platte mit Hilfe eines Chromatogramm-Spektralphotometers. Wegen des hohen Material- und Zeitaufwandes sind diese Verfahren für die Schule ungeeignet. Auch deshalb wurden sie nicht durchgeführt.

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