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Alle folgenden Methoden gehen von einem homogenisierten Probenmaterial aus. Es sind analysenreine Chemikalien zu verwenden. Das Wasser muß entweder destilliert oder von entsprechender Reinheit sein. Die Herstellungsmengen der Reagenzien sind an den jeweiligen Versuchsumfang anzupassen. Die angegebenen Gerätezahlen beziehen sich auf die Analyse einer Probe.
Bei der Durchführung von mehreren Bestimmungsansätzen (1, 2 ..) einer Versuchsreihe wurde der jeweilige Extinktionsmittelwert der Bestimmungsansätze zur weiteren Berechnung eingesetzt. Das Endergebnis wurde als Mittelwert der entsprechenden Versuchsreihen (I, II) angegeben. Für weitere Umrechnungen wurde dann dieser Mittelwert eingesetzt. Den Umrechnungen wurde die Beziehung der Molgewichte zugrunde gelegt.
F = [M(gesucht)] / [M(bekannt)][50] [51]
4.3.1.1. Bestimmung des Pökelfarbstoffes nach Hornsey (1956), modifiziert durch A. Mirna und G. Schütz (1972)[21] [22]
4.3.1.1.1. Arbeitsablauf
Chemikalien: Aceton, konz. HCl
Geräte: Ultra Turrax, ein hartes Rundfilter, ein 50ml, ein schmales 150ml, ein schmales 250 ml Becherglas, zwei 50ml Meßzylinder, ein 200ml Kohlrauschkolben, zwei Uhrgläser, ein Trichter, 25ml Vollpipette, Pipettierhilfe, Präzisionspipette (0,25 ml), Spektralphotometer (530nm)
Herstellen des Probenfiltrates
In einem Becherglas werden 20 g des Probenmaterials mit 30 ml Wasser und dem gleichen Volumen Aceton versetzt. Mit dem Ultra Turax wird alles für ca. 30 sek. homogenisiert. Unter Nachwaschen mit Aceton führt man den Fleischbrei quantitativ in einen 200 ml Kohlrauschkolben über, füllt mit Aceton bis zur Marke auf und bedeckt den Kolben mit einem Uhrglas (Verdunstungsverlust!). Im Dunkeln läßt man 15 min extrahieren. Anschließend wird das rötliche Extrakt filtriert (Zeitdauer 20 - 30 min). Das erhaltene Filtrat muß vollkommen klar sein.
Herstellen der Meßlösung
25ml des Acetonextraktes werden mit 0,25ml konz. Salzsäure versetzt und durchmischt. Nach 15 min kann die Extinktion bei 530nm gegen einen entsprechenden Blindwert gemessen werden.
4.3.1.1.2. Meßergebnisse
Proben Nr 1 2 3 4 5 6 7 y I 0,006 0,086 0,040 0,030 0,089 0,052 0,013 y II 0,006 0,090 0,041 0,031 0,084 0,031 0,014 y III 0,007 0,084 0,040 0,030 0,087 0,039 0,013 y NOMb 0,006 0,087 0,040 0,030 0,087 0,041 0,013
Tab. 9: Meßergebnisse zum Pökelfarbstoffgehalt
4.3.1.1.3. Berechnung des Gehaltes an Pökelfarbstoff
Um aus den Meßergebnissen die Menge an Pökelfarbstoff berechnen zu können, wird folgende Beziehung zu Grunde gelegt:
E = epsilon · c · d
d.h., die Extinktion ist eine Eigenschaft der jeweiligen Probe, sie verändert sich mit der Probenkonzentration und der Schichtdicke der Lösung, während E abhängig von der Wellenlänge ist. Für jede absorbierende Substanz ergibt sich eine bestimmte Funktion f(lambda). Mit Hilfe der Beziehung
c = E/(epsilon · d) (mit c = n/V, n = m/M)
m = (E · M · V) / (epsilon · d)
der Annahme gelöstes NOMb liegt in der Form von Hämin (M = 652g/mol) vor und unter Berücksichtigung der von Hornsey verwendeten Standardbedingungen (V=50ml, lambda=540nm, d=1cm, a=10g) sowie des ermittelten Extinktionskoeffizienten (epsilon540nm von Hämin in 80%igen Aceton = 11,3 ml/(mmol·cm)), erhält man den Hämingehalt pro 10g Probe für eine Extinktion y=1. Dieser Wert kann umgerechnet werden in mg Hämin pro kg Probe
m = (E · M · V) / (epsilon · d · a)
und ergibt gerundet 290 mg Hämin pro kg Probe, d.h., eine gemessene Extinktion bei 540nm multipliziert mit Faktor 290 ergibt die Konzentration des NOMb, berechnet als ppm Hämin.
Da hier andere Versuchsbedingungen eingesetzt wurden, müssen Modifikationen im Rechenweg vorgenommen werden. Es ergeben sich somit Korrekturfaktoren:
1,11 = Umrechnungsfaktor, der bei 530 nm gemessenen Extinktion auf den entsprechenden Wert bei 540 nm
2 = Verdünnungsfaktor (20 g pro 200 ml)
Um das von Hornsey angegebene Ergebnis als mg Hämin pro kg Probe auf mg NOMb pro kg Probe umzurechnen, wird ein Umrechnungsfaktor F ermittelt
F = [M (NOMb)] / [M (Hämin)] = 16930 g/mol / 652 g/mol = 25.9 ~ 26.
Aus all dem resultiert die Beziehung:
E (530 nm) · 290 · 2 · 1,11 · 26,0 = E (530 nm) · 16740 = mg NOMb pro kg Probe[22]
Aufgrund der bei Hornsey vorliegenden Ergebnis- und Rundungsangaben bei den Umrechnungsfaktoren werden die Ergebnisse ohne Dezimalstellen angegeben.(Tab. 11)
4.3.1.2. Bestimmung des Gehaltes an Gesamtfarbstoff nach H.C. Hornsey (1956) modifiziert durch A. Mirna und G. Schütz (1972)[21][22]
4.3.1.2.1. Arbeitsablauf
Chemikalien: Aceton, konz. HCl
Geräte: 500 ml Meßkolben, 10 ml, 250 ml Meßzylinder, schmales 150 ml, 250 ml Becherglas, 200 ml Kohlrauschkolben, zwei Uhrgläser, hartes Rundfilter, Trichter, Spektralphotometer (530 nm)
Herstellen der Stammlösung
In einem 500 ml Meßkolben werden 140 ml Wasser mit 10 ml konz. HCl versetzt, dann wird mit Aceton zur Marke aufgefüllt (Volumenkontraktion beachten!)
Herstellen der Probenmeßlösung
In einem Becherglas werden 20 g Probe mit 100 ml Stammlösung versetzt und mit dem Ultra Turax für 30 sek. homogenisiert. Dann führt man den Fleischbrei unter Nachwaschen mit Aceton quantitativ in einen Kohlrauschkolben über und füllt mit Aceton zur Marke auf. Mit einem Uhrglas bedeckt läßt man 60 min im Kühlschrank extrahieren. Nach der Filtration unter Abdeckung mit Uhrgläsern wird die Extinktion der klaren rotbraunen Lösung bei 530 nm gegen einen entsprechenden Blindwert gemessen.
4.3.1.2.2. Meßergebnisse
Proben Nr 1 2 3 4 5 6 7 y I 0,053 0,147 0,070 0,067 0,146 0,139 0,105 y II 0,056 0,140 0,075 0,064 0,149 0,120 0,107 y III 0,054 0,150 0,071 0,063 0,147 0,152 0,108 y Mb 0,054 0,148 0,072 0,065 0,147 0,137 0,107
Tab. 10: Meßergebnisse zum Gesamtfarbstoffgehalt
4.3.1.2.3. Berechnung des Gehaltes an Gesamtfarbstoff
Zur Umrechnung der Meßergebnisse in das Hämin wurden von Hornsey Faktoren bestimmt. Unter seinen verwendeten Standardbedingungen (V = 50 ml, d = 1 cm, a = 10 g, lambda = 640 nm) und der Annahme, die Pigmente liegen alle als Hämin (M = 652 g/mol) vor, ergibt sich mit dem bestimmten Extinktionskoeffizienten (epsilon640 nm von Hämin in 80 %igen Aceton = 4,80 ml/(mmol · cm)) für die Extinktion y=1 der Faktor m = 680 [m=(E · V · M) / (epsilon · d · a)]. Ein Meßergebnis multipliziert mit 680 ergibt also den Gehalt an Gesamtpigment, berechnet als ppm Hämin.
Um diese Methode auf die hier verwendeten Bedingungen anzupassen, sind Korrekturfaktoren notwendig:
0,522 = Umrechnungsfaktor, der bei 530 nm gemessenen Extinktion auf den entsprechenden Wert bei 640 nm
2 = Verdünnungsfaktor (20 g pro 200 ml; Hornsey 10 g pro 50 ml)
25,9 = Umrechnungsfaktor F, um Ergebnis in ppm Myoglobin angeben zu können
F = [M (Mb)] / [M (Hämin)] = 16900 g/mol / 652 g/mol = 25,9). Daraus resultiert die Beziehung:
E (530 nm) · 680 · 2 · 0,522 · 25,9 = E (530 nm) · 18390 = mg Mb pro kg Probe[22]
Die Angabe der Ergebnisse (Tab. 11) erfolgt ohne Dezimalstellen aus schon genannten Gründen.
4.3.1.3. Berechnung der prozentualen Umrötung
Um zweckmäßigere Aussagen über die ermittelten Ergebnisse machen zu können (der Pigmentgehalt schwankt ohnehin von Natur aus) wird das Verhältnis von NOMb zum vorhandenen Gesamtpigmentgehalt gebildet.
In den durchgeführten Methoden liegen alle Pigmente in der Häminform vor, so daß die entsprechenden Extinktionen zur Berechnung eingesetzt werden können. Es ergibt sich:
% Umrötung = [E (NOMb)] / [E (Mb)] x 100
Proben Nr 1 2 3 4 5 6 7 y NOMb 0,006 0,087 0,040 0,030 0,087 0,041 0,013 y Mb 0,054 0,148 0,072 0,065 0,147 0,137 0,107 NOMb [mg/kg] 105 1451 675 507 1451 681 296 Mb [mg/kg] 999 2716 1324 1190 2709 2519 1962 Umrötung [%] 11 59 56 47 59 30 12
Tab. 11: Ergebnisse zur Bestimmungsmethode nach Hornsey
Mögliche Vereinfachungen: Austausch der Kohlrauschkolben gegen (200 ml) Meßkolben ist möglich. Dabei müssen allerdings die Verstopfungen beim Ausgießen des Extraktes mittels Glasstäbchen beseitigt werden. Die Extraktionslösungen können auch "kolorimetrisch" im Vergleich untereinander betrachtet werden, falls kein Photometer vorhanden ist.
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