Chemikalien: K4 [Fe (CN)6] · 3H2O, Zn (CH3COO)2 · 2H2O, Sulfanilamid, konz. HCl, NED, KNO3, NaNO2, Bromthymolblau, Ethanol (vergällt, w = 96%), NaOH (c = 1 mol / l), Testkombination zur enzym. Nitratbestimmung, Titriplex III
Geräte: Ultra Turax, beheizbares Wasserbad, Stativ, Muffen, Analysenwaage, Präzisionswaage, beheizbarer Magnetrührer, Indikatorpapier, neun Faltenfilter, neun Trichter, Spritzflasche aus Glas, ein 200 ml Weithalserlenmeyerkolben, zwei 100 ml, ein 200 ml, zehn 250 ml, vier 500 ml Meßkolben, zwei 50 ml, drei 100 ml Meßzylinder, zwei 50 ml, 18 400 ml Bechergläser, je zwei 1, 2, 3, 10, 20, 25, 30, 40 ml Vollpipetten, Pipettierhilfen, 3 ml Meßpipette, 18 Reagenzgläser, Spektralphotometer (540 nm), Zeitmeßgerät, ein braunes Fläschchen, 2 braune Flaschen
Herstellen der Reagenzien
Carrez-Lösung I: [K4[Fe(CN)6] · 3H2O] = 150 g/l
Die Lösung ist in einer braunen Flasche aufzubewahren und wöchentlich zu erneuern.
Carrez-Lösung II: [Zn(CH3COO)2 · 2H2O] = 230 g/l
Die Lösung ist in einer braunen Flasche aufzubewahren.
Farbreagenz I: In einem 200 ml Meßkolben werden 1,6 g Sulfanilamid in 100 ml Wasser unter Erwärmen gelöst. Nach Abkühlen auf RT werden unter ständigem Rühren 66 ml konz. Salzsäure zugesetzt. Dann wird mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Die Lösung ist klar und farblos; zu Beginn der HCl-Zugabe nimmt sie einen rosa Farbton an.
Farbreagenz II: In einen 250 ml Meßkolben werden 0,33 g NED mit Wasser gelöst, bevor mit Wasser zur Marke aufgefüllt wird. Die Lösung ist klar und bräunlich gefärbt.
Beide Lösungen sind in braunen Flaschen aufzubewahren. Farbreagenz II muß wöchentlich erneuert werden.
Farbreagenzmischung: Am Tage der Verwendung mischt man gleiche Volumenanteile der beiden Farbreagenzien
Indikatorlösung: 0,2 g Bromthymolblau werden in 100 ml Ethanol gelöst. Die orange Lösung ist mehrere Wochen haltbar.
Herstellen der Probenlösung
Etwa 10 g der Probe werden auf 1 mg genau in einen Weithalserlenmeyerkolben eingewogen, mit 50 ml Wasser versetzt und für 30 - 60 sek. mit dem Ultra Turax homogenisiert. Am Schaft anhaftende Reste werden mit heißem Wasser (Glasspritzflasche) in den Kolben gespült. Anschließend wird mit Natronlauge der jeweilige pH-Wert, mit Hilfe von Indikatorpapier, eingestellt (Rohwurst: Farbton des Farbumschlages: graugrün, pH sollte nicht über 8,5 liegen; Brühwurst: Farbton: blaugrün, pH kann bis 9,5 ansteigen; Kochwurst: Farbton: graugrün, pH kann bis 9,5 ansteigen). Danach wird im siedenden Wasserbad 15 min erhitzt, wobei wiederholt umgeschüttelt werden muß. Nach Abkühlen auf RT wird der Inhalt mit Wasser quantitativ in einen 250 ml Meßkolben überführt. Nacheinander, unter Umschütteln, gibt man je 2 ml Carrez I und Carrez II zu, wodurch ein voluminöser weißgelber Niederschlag entsteht. Mit Wasser wird bis zur Marke aufgefüllt und durchmischt. Der Brei wird durch ein Faltenfilter filtriert, die ersten Anteile werden verworfen. Das klare farblose Filtrat stellt die Probenlösung für beide Bestimmungen dar.
Herstellen der NaNO2-Vergleichslösungen
Natriumnitrit Stammlösung: 200 mg NaNO2 werden auf 0,1 mg genau in einen 500 ml Meßkolben eingewogen und in Wasser gelöst. Mit Wasser wird zur Marke aufgefüllt. Davon werden 25 ml in einen 500 ml Meßkolben pipettiert, mit Wasser wird zur Marke aufgefüllt.
Natriumnitrit Standardlösungen: Jeweils 10, 20, 30 und 40 ml der Stammlösung werden in 250 ml Meßkolben pipettiert, mit 0,2 ml Indikatorlösung versetzt und mit Natronlauge bis zum Farbumschlag nach blau titriert. Nach Zugabe von etwas Wasser werden nacheinander je 2 ml Carrez I und Carrez II zugegeben. Nach Auffüllen mit Wasser bis zur Marke wird durch ein Faltenfilter filtriert, wobei die ersten trüben Anteile des Filtrates verworfen werden.
Alle Lösungen müssen am Tag der Verwendung frisch hergestellt werden.
Herstellen der KNO3-Vergleichslösungen
Kaliumnitrat Stammlösung: 300 mg KNO3 werden auf 0,1 mg genau in einen 500 ml Meßkolben eingewogen und mit Wasser gelöst. Dann wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt. 25 ml dieser Lösung werden in einen 500 ml Meßkolben pipettiert, mit Wasser wird zur Marke aufgefüllt.
Kaliumnitrat Standardlösungen: die Vorgehensweise entspricht der bei den NaNO2-Standardlösungen.
Bestimmung des Nitritgehaltes
Es wird ein zweifacher Ansatz je Probenlösung durchgeführt. Je 2 ml der Probenlösung werden in einem Reagenzglas mit 1 ml Wasser und 3 ml der Farbreagenzmischung versetzt und durchmischt. Nach Aufbewahrung für 30 min im Dunkeln werden die Extinktionen der roten Meßlösungen bei 540 nm im Spektralphotometer gegen einen entsprechenden Blindwert gemessen. Zur Erstellung der Eichgeraden werden anstelle der Probenlösung jeweils 2ml der NaNO2-Standardlösungen verwendet und wie oben beschrieben behandelt.
Bestimmung des Gesamt-Nitrit-Nitratgehaltes
Aufgrund des Kostenfaktors wird auf einen zweifachen Ansatz verzichtet. Die Bestimmung erfolgt als Nitrit (*Reagenzien sind in der Testkombination enthalten).
Puffer- / Enzymlösung: In ein braunes Fläschchen (A) werden 50 mg Titriplex III eingewogen. Zum Inhalt einer Flasche (B) Nitrat-Reductase* werden 3 ml Imidazol-Pufferlösung* gegeben. Mit weiteren 9 ml Pufferlösung* wird die Lösung (B) quantitativ in A überspült. Diese Lösung ist bei 4 °C etwa 14 Tage haltbar.
In einem Reagenzglas werden eine NADPH-Tablette*, 2 ml der Probenlösung und 1 ml der Puffer-/Enzymlösung miteinander gemischt. Bei RT wird der Ansatz für 60 min stehen gelassen. Anschließend wird nach Zugabe von 3 ml der Farbreagenzmischung umgeschüttelt und für 30 min ins Dunkle gestellt. Die Extinktion der roten Lösung kann bei 540 nm im Spektralphotometer gegen einen entsprechenden Blindwert gemessen werden. Zur Erstellung der Eichgeraden werden anstelle der Probenlösung jeweils 2 ml der KNO3-Standardlösungen verwendet und wie oben beschrieben behandelt.
Eine Vereinfachung der Versuchsdurchführung dieser Methode konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erarbeitet werden.
Nitritbestimmung
Proben Nr
1 2 3 4 5 6
aI [g] 9,990 10,630 10,511 10,050 10,181 10,432
yI.1 0,006 0,146 0,156 0,159 0,049 0,065
yI.2 0,006 0,150 0,159 0,150 0,049 0,064
yI 0,006 0,148 0,1575 0,1545 0,049 0,0645
aII [g] 10,631 10,292 10,723 10,381 10,101 10,034
yII.1 0,005 0,146 0,158 0,168 0,053 0,058
yII.2 0,006 0,147 0,160 0,156 0,052 0,060
yII 0,055 0,1465 0,159 0,162 0,0525 0,059
Tab. 12a: Meßergebnisse zur NO2--Bestimmung
Standardmeßlösung
A B
C D
y1 0,153 0,308 0,449 0,608
y2 0,154 0,308 0,460 0,608
y 0,1535 0,308 0,4545 0,608
Tab. 12 b: Meßergebnisse zur NO2--Bestimmung
Gesamt-NO2--NO3--Bestimmung
Proben Nr
1 2 3 4 5 6
aI [ g ] 9,990 10,630 10,511 10,050 10,181 10,432
yI 0,101 0,283 0,298 0,234 0,396 0,283
aII [ g ] 10,631 10,292 10,723 10,381 10,101 10,034
yII 0,112 0,257 0,286 0,262 0,384 0,278
Tab. 13a: Meßergebnisse zur Gesamt-NO2--NO3--Bestimmung
Standardmeßlösung
A B C D
y 0,174 0,247 0,376 0,451
Tab. 13b: Meßergebnisse zur Gesamt-NO2--NO3--Bestimmung
Natriumnitritgehalte der Vergleichslösungen
NaNO2-Stammlösung
200 mg NaNO2 in 500 ml davon 25 ml Ansatz wird auf 500 ml mit Wasser aufgefüllt. Die Lösung enthält 10 mg NaNO2 pro 500 ml
NaNO2-Standardmeßlösungen
Je 2 ml der Standardlösungen enthalten:
A: 0,0016 mg NaNO2 (xA) C: 0,0048 mg NaNO2 (xC)
B: 0,0032 mg NaNO2 (xB) D: 0,0064 mg NaNO2 (xD)
Graphische Auswertung
Mit Hilfe der ermittelten Extinktionen (yn) und den NaNO2-Konzentrationen (xn) kann die Eichgerade erstellt werden (mit n = A, ...,D)
Durch Extrapolation in der Eichgerade sowie der Beziehung w1(m) = (xm · 125 · 1000) / am und unter Berücksichtigung der entsprechenden Versuchsbedingungen (V = 250 ml, Probeneinwaage am), erhält man den NaNO2 -Gehalt in mg NaNO2 pro kg Probe (mit xm = mg NaNO2 pro 2 ml Probenmeßlösung, m = 1,..,6)
Auswertung mit Hilfe der Regressionsrechnung[31][32]
Um die doch recht ungenauen Extrapolationen bzw. die Ablesefehler zu umgehen, kann der NaNO2 -Gehalt mittels Faktoren berechnet werden. Die zur Eichkurve zugehörigen Konstanten B, A lassen sich berechnen:
A = yA + 0,5 yB - 0,5yD = 0,0035 (mit yA = 0,1535, yB = 0,308, yD = 0,608)
B = = 0,00755
(mit yA = 0,1535, yB = 0,308, yC = 0,4545, yD = 0,608)
Der Gehalt an NaNO2 berechnet als mg NaNO2pro kg Probe (w1) kann mit Hilfe der Beziehung
w1(m) =
unter Beachtung der entsprechenden Werte ermittelt werden. An dieser Stelle sei auf eine Darstellung der Rechenwege verzichtet, da sie analog der in Kapitel 3.3.5.1.3. aufgeführten Rechenschritte verlaufen (vgl. dort).
Fehlerabschätzung
Bei der Bestimmungsmethode handelt es sich um eine mittelbare Messung, d.h., es liegt eine zusammengesetzte Größe f (wNaNO) vor, in deren Berechnung mehrere unmittelbar gemessene Größen x, y, z (hier: a, y, A, B) eingehen. Es besteht der Zusammenhang f = f(x, y, z...). Zudem liegen systematische Fehler vor. Deshalb werden die Auswirkungen der Größtfehler (d.h. maximal mögliche Abweichung des Meßwertes vom wahren Wert) x, y, z, .. auf f ermittelt f/f = || x/x + || y/y +....
Bei der NaNO2-Bestimmung wurden einige Arbeitsschritte nicht berücksichtigt, da diese keinen Einfluß auf das Endergebnis ausüben. Dies sind: Herstellen der Carrez I, II und der Indikatorlösung sowie deren Zugabenmengen zur Probe, Herstellen der Farbreagenzien und die Zeitmessung. Da die Werte für die Eichkurve und die für die Proben gleichzeitig bestimmt wurden, kann der Fehler des Spektralphotometers vernachlässigt werden.
Größtfehler:
Probenaufarbeitung: a (Analysenwaage) = 0,1 mg, b (250 ml Mk) = 0,23 ml,
c (2 ml V.p.) = 0,012 ml
Bestimmung: d (1 ml V.p.) = 0,011 ml, e (3 ml V.p.) = 0,013 ml
NaNO2-Stammlösung: g (Analysenwaage) = 0,1 mg, h (500 ml Mk) = 0,38 ml,
i (25 ml V.p.) = 0,033 ml, j (500 ml Mk) = 0,038 ml
NaNO2-Standardmeßlösungen:
k1:
k1.1 (10 ml V.p.) = 0,02 ml, k1.2 (250 ml Mk) = 0,23 ml
k1.3 (2 ml V.p.) = 0,012 ml, k1.4 (1 ml V.p.) = 0,011 ml
k1.5 (3 ml V.p.) = 0,013 ml
k2:
k2.1 (20 ml V.p.) = 0,03 ml,... vgl. k1
k3:
k3.1 (30 ml V.p.) = 0,04 ml,...vgl. k1
k4:
k4.1 (40 ml V.p.) = 0,05 ml,...vgl. k1
wm/wm = Probe/Probe + A/A + B/B w/w = a/a + b/b +....= 0,2072084
d.h., mit z.B. w(m) = 20,577 mg NaNO2 pro kg w(m) ~ 4 mg w(m) = 20 ± 4 mg NaNO2/kg. Aufgrund dieses Größtfehlers w der Nitritbestimmung werden die Ergebnisse ohne Dezimalen angegeben.
Proben Nr
1 2 3 4 5 6
wI[mg NaNO2/kg] 0,3 18 20 20 6 8
wII[mgNaNO2/kg] 0,3 18 19 20 6 7
w1[mgNaNO2/kg] 0,3 18,0 19,5 20,0 6,0 7,5
*w2[mgNO2-/kg] 0,2 12 13 13 4 5
Tab. 14: Nitritgehalt, *mit F = [M(NO2-)]/[M(NaNO2)] = 0,6667923
Alle Berechnungen erfolgen in analoger Weise zur Nitritbestimmung.
Kaliumnitratgehalte der Vergleichslösungen
Kaliumnitrat-Stammlösung: enthält 15 mg KNO3 pro 500 ml
Kaliumnitrat-Standardmeßlösungen
je 2 ml der Standardlösungen enthalten:
A: 0,0024 mg KNO3 (xA) C: 0,0072 mg KNO3 (xC)
B: 0,0048 mg KNO3 (xB) D: 0,0096 mg KNO3 (xD)
Die zugehörige Eichgerade erhält man durch Auftragen der für die Standardmeßlösungen erhaltenen Extinktionen (yn) gegen die entsprechenden Kaliumnitratkonzentrationen (xn) (mit n = A,...,D)
Auswertungen
Durch Extrapolation in der Eichgerade sowie der Beziehung w3(m) = (xm · 125 · 1000) / am und unter Berücksichtigung der entsprechenden Versuchsbedingungen, erhält man den Gesamtgehalt, berechnet als mg KNO3 pro kg Probe. Mit Hilfe der Regressionsrechnung[31][32] werden die Faktoren bestimmt:
A = yA + 0,5yB - 0,5yD = 0,072 (mit yA = 0,174, yB = 0,247, yD = 0,451)
B = = 0,0032
(mit yA = 0,174, yB = 0,247, yC = 0,376, yD = 0,451)
sowie: w3(m) =
Fehlerabschätzung
Diese wurde analog der in Kap. 3.3.3. durchgeführt. Unter Berücksichtigung einiger Abweichungen in der Versuchsdurchführung ergibt sich w/w = 0,2134268, d.h., mit z.B. w(m) = 35,247 mg KNO3 pro kg w(m) ~ 8 mg w(m) = 35 ± 8 mg.
Aufgrund dieses Größtfehlers w der Gesamt-NO2--NO3--Bestimmung werden die Ergebnisse ohne Dezimalen angegeben.
Proben Nr
1 2 3 4 5 6
wI[mgKNO3/kg] 9 62 67 50 99 63
wII[mgKNO3/kg] 11 56 62 57 96 64
w3 [mgKNO3/kg] 10 59 64,5 53,5 97,5 63,5
*w4[mgNaNO2/kg] 7 40 44 37 67 43
Tab. 15: Ergebnisse Gesamt-NO2--NO3--Gehalt; *mit w4=Gesamt-NO2--NO3--Gehalt als mg NaNO2 pro kg, F=[M(NaNO2)]/[M(KNO3)] = 0,6824243
Aufgrund der Fehlerabschätzung werden für die Umrechnungen die gerundeten Zahlenwerte eingesetzt.
An NOMb gebundenes NO
Unter Annahme, daß pro Molekül Mb ein Molekül NO gebunden ist sowie M(NOMb) = 16930 g/mol, M(NO) = 30 g/mol, ergibt sich die Beziehung:
E(NOMb) · 29,7 = mg NO pro kg Probe
Proben Nr
1 2 3 4 5 6
w5 [ mg NO / kg 0,2 3 1 1 3 -
]
*w6 [ mg NO2- / kg 0,3 5 2 2 5 5**
]
Tab. 16a: Berechnung des an NOMb gebundenen Nitrits im mg NO2- pro kg; *mit F=[M(NO2-)]/[M(NO)]=1,5332042; **Bestimmungsmethode bei P6 nicht durchführbar Annahme: 5 mg NO2- pro kg
Nitritgehalt
Proben Nr
1 2 3 4 5 6
*w7 6 36 39 32 59 39
*w8 0,3 16 18 18 5 7
*w9[mgNO3-/kg] 5,7 20 21 14 54 32
Tab. 16b: Berechnung des NO3--Gehaltes in mg NO3- pro kg; *mit F7=[M(NO3-)]/[M(KNO3)]=0,6132834; F8=[M(NO3-)]/[M(NaNO2)]=0,8986834; w7=Gesamt-NO2--NO3- (vgl. Tab. 15) als mg NO3- pro kg; w8=NaNO2-Gehalt (vgl. Tab. 14) als mg NO3- pro kg; w9=w7-w8 = Nitratgehalt
Eingesetztes Nitrit
Mit Hilfe der bekannten Zugabemengen von NPS und Trinkwasser und dem bekannten NaNO2 - Gehalt von 0,4 % im NPS kann die eingesetzte Nitritmenge pro kg Probe (w10) berechnet werden. Die Werte sind als Annahmen zu betrachten, da Abwiegefehler bei der Wursterzeugung zu erwarten sind.
Proben Nr
1 2 3 4** 5 6
NPS1 [mg NaNO2/kg - 88 80 80 60 100
Fleisch, Fett]
Schüttung [%] 20 10 20 20 25 -
NPS2 [mg NaNO2/kg] - 79 64 64 45 100
*w10[mgNO2-/kg] - 53 43 43 30 67
Tab. 16c: Berechnung des durch NPS eingesetzten NO2- in mg NO2- pro kg; *mit F=[M(NO2-)]/[M(NaNO2-)]=0,6667923; **Rezeptur nicht bekannt Annahme: entspricht P3
Bilanzanalyse
P1 wird ausgeschlossen, da kein NPS zugesetzt wird. Die Nitratzufuhr (berechnet als NO2-) durch Rohstoffe (Fleisch und Gewürze) wird als Konstante (5 mg NO2- pro kg) festgelegt, die durch Trinkwasser wird berechnet (in Hof: 18 mg NO3- pro l)
Proben Nr
2 3 4 5 6
w10 53 43 43 30 67
*w11 27 29 24 44 29
Wasser NO3- [ mg
NO2-/kg ] 1 3 3 3 -
Rohstoff NO3-[ mg
NO2-/kg ] 5 5 5 5 5
*w`11 21 21 16 36 29
w6 5 2 2 5 5
*w12 [ mg NO2- / kg ]
7 20 25 -11 41
Tab. 16d: Bilanzanalyse; *mit w11=Gesamt-NO2--NO3- als mg NO2- pro kg; F=[M(NO2-)]/[M(KNO3)]=0,4550353; w'11=w11-(Wasser+Rohstoff- NO2-); F=[(NO2-)]/[(NO3-)]=0,7419657; w12=[w10-(w6+w'11)]=nicht erfaßbares Nitrit