Didaktik der Chemie / Universität Bayreuth

Stand: 28.06.16


Die Strukturaufklärung von Proteinen am Beispiel des Kälteschockproteins in Bacillus caldolyticus

Vortrag von Stephanie Hackenberg im Rahmen der "Übungen im Vortragen mit Demonstrationen - OC", SS 2015

Gliederung:


Einstieg: Im Laufe der Evolution entwickelten Organismen die verschiedensten Mechanismen, um sich an extreme Bedingungen, wie zum Beispiel Kälte, anzupassen. Im Visier der Forschung stehen dabei vor allem molekulare Mechanismen, wie etwa die Expression von Genen, die zur Synthese sogenannter cold shock proteins (csp) bei Bakterien führt. Besonders gut sind die Kälteschockproteine von Bacillus subtilis und Bacillus caldolyticus erforscht. Um zu klären, wie diese Proteine aufgebaut sein müssen, damit Kältetoleranz erreicht werden kann, ist eine Strukturanalyse dieser Proteine notwendig.

1 Aufklärung der Primärstruktur

Ganz allgemein ist die Primärstruktur eines Proteins als die Sequenz der im Protein vorkommenden Aminosäuren definiert. Diese kann beispielsweise mithilfe der folgenden Methoden geklärt werden:

  • DNA-Sequenzierung nach Maxam und Gilbert

  • DNA-Sequenzierung mithilfe der Didesoxymethode nach Sanger

  • Aminosäuresequenzierung durch Edman-Abbau mit Phenylisothiocyanat.

Die aufgeklärte Primärstruktur bietet die Grundlage für weitere Untersuchungen hinsichtlich der räumlichen Proteinstruktur. Die Analyse der Primärstruktur des Kälteschockproteins von Bacillus caldolyticus ergab, dass sich diese an nur zwölf Stellen von der Primärstruktur des Kälteschockproteins in Bacillus subtilis unterscheidet.


2 Kristallographie zur Aufklärung von Sekundär- und Tertiärstruktur

Die Sekundärstruktur von Proteinen stellt die durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den einzelnen Aminosäuren hervorgerufene Struktur dar. In den meisten Fällen resultieren daraus α-Helix und β-Faltblatt.

 
Abb. 1: Schematische Darstellung einer α-Helix-Struktur (oben) und einer β-Faltblatt-Struktur (unten)

Die Zusammensetzung mehrerer Elemente der Sekundärstruktur zu einer Kette beschreibt inklusive der resultierenden Wechselwirkungen (Disulfidbrücken, Wasserstoffbrücken) die räumliche Struktur eines Proteins in Form der Tertiärstruktur. Diese dreidimensionale Struktur ist für die biologische Funktion eines Proteins essentiell und damit ein individuelles Charakteristikum. Bei Bacillus caldolyticus wird beispielsweise durch die individuelle räumliche Struktur des Kälteschockproteins Kältetoleranz erreicht.

2.1 Einkristallzucht

Grundlagen für eine Röntgenstrukturanalyse sind neben der bereits ermittelten Aminosäuresequenz zunächst eine Überexpression des Proteins und im Anschluss daran die Aufreinigung des Proteins. Diese erfolgt in der Regel mittels SDS- und IEF-Gelelektrophorese. Den limitierenden Faktor für die Durchführung der Kristallographie stellt (namensgebend) jedoch die Züchtung eines reinen Protein-Einkristalls dar. Nicht selten dauert es einige Monate, bis dies gelingt. Meist wird hierfür die Methode des "hanging drop" gewählt.


Abb. 2: Proteinkristallzüchtung über die Dampfphase mit der "hanging drop" - Methode

Der Probetropfen wird auf ein Glasplättchen aufgetragen, womit das Gefäß, in welchem sich die Salzreservoirflüssigkeit befindet, letztlich verschlossen wird. Somit hängt der Tropfen nach unten über der Reservoirlösung, wodurch die Kontaktfläche zwischen Tropfen und Glas verkleinert wird. In dieser Position bleiben jedoch nur sehr kleine Tropfen mechanisch stabil, größere fallen aufgrund ihres Eigengewichts nach unten ab.

2.2 Röntgenstrukturanalyse

2.2.1 Prinzip

Ist die Einkristallzucht geglückt, so wird der Proteinkristall in ein sog. Goniometer eingespannt und mit gebündelten Röntgenstrahlen aus einer Röntgenquelle beschossen. Während dieser Prozedur dreht sich der Kristall im Goniometer, sodass dieser von allen Seiten in unterschiedlichen Winkeln von den Röntgenstrahlen durchdrungen wird, um letztlich eine möglichst realistische dreidimensionale Struktur hervorbringen zu können.


Abb. 3: Schematische Darstellung des Prinzips einer Röntgenstrukturanalyse

Durch die Struktur des Kristalls und seiner Elektronendichteverteilung werden die Röntgenstrahlen unterschiedlich gebeugt, wodurch sich auf einem Röntgenfilm für jeden Kristall ein charakteristisches Diffraktionsmuster ergibt.

2.2.2 Auswertung

Mithilfe von Computerprogrammen können diese "Rohdaten" nun visualisiert werden. Dabei wird ein Elektronendichte-Verteilungsnetz durch eine spezielle NMR-Technik (Furier-Transformation) erstellt, in welche die bereits bekannte Primärstruktur eingepasst wird. Daraus resultiert ein Abbild der dreidimensionalen Tertiärstruktur.

 
Abb. 4: Einpassen der Primärstruktur in das erhaltene Elektronendichteverteilungsnetz [2]

Diese Struktur wird mithilfe des Programms PROCHECK nochmals auf logische Abstände zwischen den Aminosäureresten überprüft. Nach Einbezug von Wechselwirkungen (z.B. Van-der-Waals-Kräfte, Wasserstoffbrücken) innerhalb des Moleküls, wird dieses ein letztes Mal optimiert.


Abb. 5: Tertiärstruktur von CspB in Bacillus caldolyticus [2]

Im Falle des Kälteschockproteins CspB von Bacillus caldolyticus handelte es sich allerdings nicht um eine de novo Strukturanalyse. Vielmehr spricht man hier vom Prinzip des molekularen Ersatz. Dies bedeutet, dass die räumliche Proteinstruktur rückwärts analysiert wurde, indem neue Messdaten mit der bereits bekannten Struktur (Csp von Bacillus subtilis) verglichen wurden. Für eine solche "Rückwärtsanalyse" müssen mindestens 25 % der Aminosäuresequenzen identisch sein.


3 Struktur-Funktions-Beziehung

Im Rahmen dieser Studie konnte herausgefunden werden, dass die Reste der Aminosäuren hauptsächlich aromatischer Natur sind. Wenn die DNA durch die cold shock proteins "gebunden" (nicht im Sinne der chemischen Bindung), wird diese isoliert und nimmt somit keinen Schaden durch kalte Temperaturen, wodurch die DNA-Expression, sowie die Proteinbiosynthese selbst unter Bedingungen extremer Kälte gewährleistet werden kann.


Abschluss: Mithilfe bioanalytischer Verfahren gelingt es heute, komplexe Proteinstrukturen aufzuklären, sowie die räumliche Struktur mithilfe von Programmen sinngemäß zu visualisieren. Durch diese Technologien ist es möglich, Erkenntnisse über Struktur ím Zusammenhang mit der Funktion zu gewinnen. Im Fall von B. caldolyticus ist festzuhalten, dass die Funktion "Kältetoleranz" vor allem durch aromatische Reste der Aminosäuren erreicht werden kann, wodurch die DNA vor Kälte "isoliert" wird.


Literatur:
  1. Lottspeich F., Zorbas H. (1998). Bioanalytik, Heidelberg-Berlin, Spektrum Akademischer Verlag.
  2. Mueller U. et al. (2000). Thermal stability and Atomic-resolution Crystal Structure of the Bacillus caldolyticus cold shock protein. Journal of Molecular Biology. Volume 297. P.975-988.
  3. http://www.spektrum.de/lexikon/biologie/proteinkristallisation/54154 15.06.2016

E-Mail: Walter.Wagner ät uni-bayreuth.de