Ninhydrin

Vortrag von Markus Drechsel und Christopher Graf im Rahmen der "Übungen im Vortragen mit Demonstrationen - Organische Chemie", SS 01 und SS 10

1 Einführung

Siegfried Ruhemann entdeckte im Jahre 1911, dass Ninhydrin mit Aminosäuren und Peptiden eine blauviolette Färbung ergibt, den so genannten "Ruhemannschen Purpur". Diese Farbreaktion ist sehr empfindlich, es lassen sich damit noch sehr kleine Aminosäuremengen nachweisen. Sie kommt beispielsweise bei Dünnschicht-Chromatogrammen von Aminosäuren zum Einsatz.

Auch der Hautschweiß enthält Spuren von Aminosäuren. Fingerabdrücke auf Papier können daher mittels der Ninhydrin-Reaktion sichtbar gemacht werden.

In der Medizin wird der Ninhydrin-Test (Moberg-Test) zum Nachweis peripherer Nervenläsionen angewandt. Da die sympathischen Fasern, die die Schweißsekretion regulieren, nach Austritt aus dem Rückenmark mit den peripheren Nerven verlaufen, kommt es bei Nervenläsionen auch zum Ausfall der Schweißsekretion. Beim Moberg-Test werden Hand- oder Fußabdrücke auf Papier mit Ninhydrin-Reagenz behandelt, wobei die mit dem Schweiß freigesetzten Aminosäuren und Peptide zu einer Färbung führen.

2 Die Ninhydrin-Reaktion

2.1 Vorgelagerte Gleichgewichtsreaktionen

Im folgenden sind die wichtigsten Schritte der Ninhydrin-Reaktion abgebildet. Die Reaktion wird hier exemplarisch mit einer Aminosäure als Reaktionspartner dargestellt, weiterhin wird Ninhydrin-Reagenz benötigt. Mit Blick auf die Reaktion ist zu beachten, dass Ninhydrin aber auch die Aminosäure eigenen Gleichgewichtsreaktionen unterworfen sind.

Das Gleichgewicht zwischen Ninhydrin und seinem Hydrat bzw. die Zwitterionenstruktur der Aminosäure sind im folgenden kurz dargestellt:

2.2 Reaktionsmechanismus

Werden Aminosäuren mit dem Ninhydrin-Reagenz zusammengebracht erfolgt der erste Schritt der Reaktion. Der Stickstoff der α-Aminogruppe greift nukleophil am Carbonyl-Kohlenstoff des Ninhydrins an. Nach anschließender Wasserelemenierung entsteht die erste Zwischenstufe der Reaktion, ein Ketimin-Derivat (Abb. 3).

Abb. 3: Nukleophiler Angriff der Aminogruppe und Bildung des Ketiminderivats.

Im darauf folgenden Schritt kommt es zu einer Decarboxylierung des Ketiminderivats. Dies ist bedingt durch die räumliche Nähe von Carbonylsauerstoff und Carboxygruppe. Durch die Decarboxylierung kommt es zu einer neuen Ordnung der Bindungsverhältnisse und das Aldiminderivat wird gebildet (Abb. 4).

Durch Hydrolyse wird nun das Aldiminderivat in einen Aldehyd, der den Aminosäurerest trägt, und in ein Aminoketon, das das Ninhydringerüst beinhaltet, gespalten (Abb. 5).

Um nun zum blauen Farbstoff zu glangen, muss noch ein zweites Ninhydringerüst in das Molekül eingebaut werden. Dies erfolgt durch nukleophilen Angriff der Aminogruppe des Aminoketons an den Carbonylkohlenstoff eines zweiten Ninhydrins. Nach Elemenierung von Wasser erhält man den blau-violetten Farbstoff Ruhemanns-Purpur (Abb. 6).

Abb. 6: Nukleophiler Angriff des Aminoketons und Wasserelemenierung zum blau-violetten Farbstoff Ruhemanns Purpur.

Bei näherer Betrachtung der Reaktion bleibt festzuhalten, dass lediglich das Stickstoffatom der Aminosäure über verschiedene Zwischenstufen in das Farbstoffmolekül Eingang gefunden hat. Somit liegt der Verdacht nahe, dass auch mit anderen Verbindungen (z. B. Amine) eine Reaktion möglich ist. Auf einfache Art und Weise lässt sich somit die Spezifität der Reaktion bestimmen.

Geräte und Chemikalien:	Spritzflasche, Reagenzgläser, 1%ige Ninhydrin-Lösung in VE-Wasser, L-Alanin, Fmoc-Alanin, Isopropylamin, Brenner
Durchf. 1:	Zu einer Lösung von L-Alanin in Wasser wird Ninhydrin-Reagenz gegeben. Auf das Erhitzen wird in diesem Versuch verzichtet, um den Einfluss der Temperatur auf die Reaktionskinetik deutlich zu machen.
Beob. 1:	Die Aminosäure L-Alanin zeigt ohne Erhitzen keine sofortige Reaktion mit dem Ninhydrin-Reagenz. Lässt man das Reaktionsgefäß jedoch ca. einen Tag stehen, so tritt tief blauviolette Färbung auf. Die klassische Farbreaktion ist somit abgelaufen.
Durchf. 2:	Zu einer Lösung von L-Alanin in Wasser wird Ninhydrin-Reagenz gegeben. Es wird kurz über der nichtleuchtenden Brennerflamme erhitzt.
Beob. 2:	L-Alanin reagiert bei erhöhter Temperatur (ca. 80°C) sofort mit Ninhydrin zu einem purpurfarbenen Farbstoff.
Durchf. 3:	Hier werden L-Alanin Moleküle eingesetzt, deren Aminogruppe geschützt ist. Eine Variante ist beispielsweise der Schutz durch Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl (Fmoc). Zu einer Lösung von Fmoc-Alanin in Wasser wird Ninhydrin-Reagenz gegeben. Es wird über der nichtleuchtenden Brennerflamme erhitzt.
Beob. 3:	Die Aminogruppe ist hier dem Zugriff des Ninhydrins durch die Fmoc-Schutzgruppe entzogen. Selbst nach erfolgtem Erhitzen tritt keine Reaktion ein.
Hintergrund:	Abb. 7: Die Fmoc-Schutzgruppe - Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl
Durchf. 4:	Zu einigen Millilitern Isopropylamin wird Ninhydrin-Reagenz gegeben.
Beob. 4:	Isopropylamin reagiert bereits ohne Erhitzen mit Ninhydrin zu einem gelb-roten Farbstoff. Die bisher im Zusammenhang mit Ninhydrin beobachtete charakteristische Purpur-Färbung bleibt aus.
Interpretation:	Temperaturerhöhung beeinflusst die Kinetik der Reaktion. Ein schnellerer Reaktionsablauf ist durch Steigerung der Temperatur möglich. Durch das Ninhydrin-Reagenz zeigt sich bei α-Aminosäuren mit freien Aminogruppen eine Purpurfärbung. Somit ist diese Reaktion ein Nachweis für das Vorhandensein von Aminosäuren. Mit anderen Molekülen treten ebenfalls Farbreaktionen auf, das Ruhemanns-Purpur wird hier jedoch nicht gebildet.

3 Noch etwas zu Aminosäuren

Der Begriff "Aminosäuren" weist auf das Vorhandensein mindestens einer Amino- und mindestens einer Carboxylgruppe hin. Für die Stellung dieser Gruppen ergeben sich jedoch unterschiedliche Möglichkeiten:

Durch das Einführen einer Aminogruppe in α-Position entsteht ein chirales Zentrum, das Molekül selbst wird asymmetrisch. Ein Maß für die Chiralität ist die Sequenzregel von Cahn, Ingold und Prelog, die die R-/S-Nomenklatur eingeführt haben. Die historische Einteilung, die von den Naturstoffen herrührt, ist die D-/L-Nomenklatur.

Bei Aminosäuren stehen noch weitere Möglichkeiten der Klassifizierung zur Verfügung. Man unterscheidet ferner (nur einige Beispiele):

4 Umsatzkontrolle bei der Festphasen-Peptid-Synthese

Peptide werden aus α-Aminosäuren aufgebaut. Ihre Synthese ist von großer Bedeutung und mit einigen Schwierigkeiten verbunden. Ein Arbeiten mit Schutzgruppen und Aktivierungsreagentien ist unumgänglich. Ein wichtiges Verfahren, bei dem auch die Ninhydrin-Reaktion eine Rolle spielt, ist die Synthese an der festen Phase.

Hierbei wird die erste Aminosäure an ein Harz (in den folgenden Gleichungen als R gekennzeichnet) geknüpft (Merrifield-Technik). Diese Bindung wird erst nach vollständig abgeschlossener Synthese durch Verseifung gelöst. Durch diese Verankerung wird der Gesamtprozess automatisierbar, so dass eine Großproduktion von Peptiden möglich ist.

Die Aminogruppe der zweiten Aminosäure muss geschützt werden. Eine Möglichkeit hierfür ist die Fmoc-Schutzgruppe (Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl). Das bei der Kondensationsreaktion entstehende Wasser wird durch Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) abgefangen.

Gemäß diesen Vorgaben ist im folgenden die Synthese eines Dipeptids dargestellt:

Für die Peptidsynthese ist es außerordentlich wichtig, den Reaktionsverlauf zu kontrollieren. Der Umsatz muss nahezu quantitativ verlaufen. Zur Überprüfung zieht man eine kleine Probe aus dem Reaktionsgemisch und führt den Kaiser-Test durch.

Färbt sich die Testlösung blauviolett, so sind noch freie α-Aminogruppen vorhanden und die Reaktion ist noch nicht beendet.

Ninhydrin - was weiß man über die Reaktion?