DNA-SequenzierungVortrag von: Melanie Pesek und Arno Leonhardt im Rahmen der "Übungen im Vortragen mit Demonstrationen - Organische Chemie", SS 2006 und SS 2008
Gliederung:
EinführungKaspar Hauser (*April 1812; Dezember 1833 ermordet in Ansbach, Franken) war ein Findelkind ungeklärter Herkunft. Sein geistiger Zustand erregte das Interesse von Juristen, Theologen und Pädagogen, die zahlreiche Untersuchungen mit ihm durchführten und ihm richtiges Sprechen beibrachten. Aufgrund dessen wurde vermutet, dass Kaspar Hauser lange Zeit einsam in einem Verlies gefangen gehalten wurde. Aufgrund seiner Beschreibungen über seine Gefangenschaft und großen Ähnlichkeiten mit Besitztümern des Hauses Baden, rankten sich schon zu Kaspar Hausers Lebzeit Gerüchte um seine Abstammung. Anselm von Feuerbach war überzeugt, dass er ein badischer Erbprinz sei, der aus dynastischen Gründen nach seiner Geburt mit einem sterbenden Kind vertauscht wurde. Diese Spekulationen beschäftigen auch heute noch die Öffentlichkeit. 1996 wurde im Auftrag des Magazins "Der Spiegel" das Blut auf der Unterhose Kaspar Hausers, die er während seiner Ermordung trug, entnommen und mittels DNA-Analyse untersucht. [3]
1 DNA-AufbauVon wenigen Ausnahmen abgesehen sind Nucleinsäuren lineare Polymere von Nucleotiden, deren Phosphatreste die 3- und 5-Positionen aufeinander folgender Zucker-Reste verbinden. Verwendete Bausteine sind so genannte Desoxyribonucleosidtriphosphate. [1]
2 Strategie der DNA-SequenzierungDie Strategie der DNA-Sequenzierung stellt erstens der spezifische Abbau und die Fraktionierung eines gegebenen Polynucleotids zu kleinen, vollständig sequenzierbaren Fragmenten dar. Als nächsten Schritt werden die einzelnen Fragmente sequenziert. Nach der Sequenzierung folgt das Ordnen der Fragmente mittels einer Wiederholung der ersten beiden Schritte. Hierbei wird durch einen veränderten Abbau ein Satz überlappender Fragmente generiert. [1]
3 RestriktionsendonucleasenTyp II Restriktionsenzyme schneiden DNA innerhalb einer spezifischen Erkennungssequenz, weshalb sie unentbehrliche biochemische Werkzeuge sind. Die Erkennungssequenzen der meisten Restriktionsenzyme besitzen eine zweizählige Rotationssymmetrie. Solche Sequenzen werden als Palindrome bezeichnet (Ein Palindrom ist ein Wort, Vers oder Satz, der sich vorwärts wie rückwärts gleich liest). [1]
4 Kettenabbruchmethode (Didesoxy-Methode nach Sanger)Ziel der Kettenabbruchmethode ist es die DNA-Replikation der einsträngig vorliegenden Fragmente an verschiedenen Synthesestellen zu stoppen. Benötigte Materialien sind das Enzym DNA-Polymerase I, die notwendigen Primer und die markierten Bausteine. 4.1 Allgemeine DNA-Synthese
DNA-Polymerase I verknüpft Desoxynucleosidtriphosphate in Gegenwart einer DNA-Matrize miteinander (replizierter Strang wird in 5-3-Richtung verknüpft). Die Reaktion verläuft über einen nucleophilen Angriff der endständigen 3-OH-Gruppe der wachsenden DNA-Kette auf die alpha-Phosphorsäuregruppe des hinzukommenden Nucleosidtriphosphats. Zum Start der Reaktion wird ein Primer benötigt, da DNA-Polymerase I nur an das 3-Ende des Polynucleotids Desoxyribonucleotide anfügen kann. Die vier Desoxyribonucleosidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) werden durch das Enzym dem komplementären Strang entsprechend ergänzt. [1] 4.2 Synthese bei SangerBei der Sequenzierung werden der Matrizen-Strang, der geeignete Primer und die 4 Desoxyribonucleosidtriphosphate (eines mindestens [alpha-P] markiert, meist dATP) zusätzlich eine kleine Menge des 2, 3Didesoxyribonucleosidtriphosphat-Analogons (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) zur Reaktion gebracht. [1,4]
Werden diese Analoga eingebaut, kann durch die fehlende 3-OH-Gruppe der Strang nicht weiter synthetisiert werden und es kommt zum Kettenabbruch. Durch den geringen Einsatz kommt es statistisch jeweils an verschiedenen Stellen des Strangs zu einem Kettenabbruch. Jedes der Didesoxy-Analoga der vier Basen wird in einem separaten Reaktionsgefäß verwendet. Ansätze werden auf einem Sequenzierungsgel in parallelen Lauflinien elektrophoretisch getrennt. Sequenz des synthetisierten Strangs kann direkt aus dem Autoradiogramm abgelesen werden (allerdings komplementär zur Matrize). [1] 4.3 Probleme des AutoradiogrammsDie Sequenzierung mittels eines Autoradiogramms wirft aber auch Probleme auf. Es ist schwierig alle 4 Ansätze richtig abzulesen. Weiterhin ist eine wirkliche Sequenzierung nur am Ende des Gels möglich, da die Banden am Anfang des Gels nicht gut zu trennen sind. Daraus folgt gleichzeitig, dass die Auflösung des Gels bei großen DNA-Stücken nicht mehr ausreicht. Außerdem ist die Handhabung von radioaktiven Materialien problematisch.
5 Abwandlungen der Sanger-MethodeBei der Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen ergeben sich Vorteile gegenüber Autoradiogrammen: Die DNA-Banden werden während der Wanderung im Gel ausgewertet, so dass es keinen Verlust von Informationen bedeutet, wenn diese auf der Seite der Anode aus dem Gel laufen. Durch die mögliche Automatisierung können die Sequenzdaten gleich an einen Computer weitergegeben werden. Markiert man zudem die Didesoxynucleotide jeweils mit einem anderen Farbstoff, ist nur ein Ansatz zur Sequenzierung notwendig. [5]
Ergebnisse der Kaspar-Hauser-UntersuchungenZur Verwandtschaftsklärung wurde ein Vergleich der DNA Kaspar Hausers mit der direkten Nachfahrin Astrid von Medinger des Hauses Baden durchgeführt: Die Spiegeluntersuchung (1996) stützte sich nur auf ein Indiz (Unterhose) und veröffentlichte, dass Kaspar Hauser kein Angehöriger des Hauses Baden sein könnte. Neuere Untersuchungen (2002) benutzten Haare, Schweiß, Hut, und Hose Kaspar Hausers für die DNA-Analyse und verglichen sie mit der direkten Nachfahrin. Diese Untersuchung ergab, dass sich die DNA nur an einer Stelle unterscheidet. Zum jetzigen Zeitpunkt wäre es unverantwortlich einen Ausschluss zu formulieren, so dass immer noch die Möglichkeit besteht, dass Kaspar Hauser ein biologischer Verwandter zum Hause Baden ist.
6 Literatur:
E-Mail: Walter.Wagner ät uni-bayreuth.de, Stand: 20.09.10 |
